Wie man Ultraschall zur Zellaufschlüsselung und DNA/RNA-Extraktion verwendet?

Wie man Ultraschall zur Zellaufschließung und DNA/RNA-Extraktion verwendet?

Ultraschall ist eine effiziente und häufig verwendete Technologie zur Zellaufschließung und Nukleinsäureextraktion (DNA/RNA). Sein Kernprinzip ist die Nutzung des Kavitationseffekts und mechanischer Vibrationen, um die Zellstruktur zu zerstören und innere Substanzen freizusetzen. Im Folgenden wird dies anhand des spezifischen Mechanismus, des Anwendungsverfahrens und wichtiger Vorsichtsmaßnahmen erläutert:

I. Prinzip und Verfahren der Ultraschallanwendung zur Zellaufschließung
Der Kern der Zellaufschließung ist die Zerstörung der Zellmembran (tierische Zellen) oder der Zellwand + Zellmembran (Pflanzen, Bakterien, Pilze usw.), um intrazelluläre Substanzen (wie Nukleinsäuren, Proteine, Organellen usw.) freizusetzen. Ultraschall erreicht diesen Prozess durch folgende Mechanismen:
1. Kernprinzip: Kavitationseffekt
Ultraschall ist eine hochfrequente mechanische Welle mit einer Frequenz von mehr als 20 kHz. Wenn die Ultraschallsonde (Verstärker des Ultraschallaufschlussgeräts) in eine flüssige Probe mit Zellen eingeführt wird, werden hochfrequente Schwingungen (normalerweise 15-50 kHz) erzeugt, die in dem flüssigen Medium Kavitation auslösen:

Hochfrequente Schwingungen führen dazu, dass sich eine große Anzahl winziger Blasen (Kavitationsblasen) in der Flüssigkeit bildet. Diese Blasen dehnen sich unter Druckänderungen schnell aus und ziehen sich zusammen und platzen schließlich heftig (kollabieren).
Wenn Blasen platzen, wird enorme momentane Energie (lokale hohe Temperatur, hoher Druck und starke Schockwellen) freigesetzt, und die erzeugte Aufprallkraft zerreißt direkt die Membranstruktur der Zelle (Zellmembran, Zellwand), um eine Zellfragmentierung zu erreichen.
2. Hilfseffekt: mechanische Vibration und Scherkraft
Die hochfrequente mechanische Vibration des Ultraschalls erzeugt auch direkt Scherkräfte und Reibungskräfte auf die Zellen, was zusätzlich die Zerstörung der Zellstruktur unterstützt, insbesondere bei Zellen mit dicken Zellwänden (wie Pilze und Pflanzenzellen).
3. Fragmentierungsprozess (am Beispiel der experimentellen Durchführung)
Geben Sie die zu behandelnde Zellsuspension (z. B. Bakterienkulturflüssigkeit, Gewebehomogenat usw.) in ein Zentrifugenröhrchen oder einen Becher, führen Sie die Ultraschallsonde (Horn) ein, und die Sonde muss in die Flüssigkeit eingetaucht sein, aber nicht mit der Behälterwand in Berührung kommen.

Schalten Sie das Ultraschallgerät ein und stellen Sie die Parameter ein (Leistung, Zeit usw.): Hochfrequente Schwingungen erzeugen Kavitationsblasen in der Flüssigkeit, und die Aufprallkraft, die durch das Platzen der Blasen erzeugt wird, zerstört direkt die Zellstruktur und setzt intrazelluläre Substanzen frei (einschließlich Nukleinsäuren, Proteine, Metabolite usw.).
2. Spezifische Anwendung von Ultraschall bei der DNA/RNA-Extraktion
Die Kernschritte der DNA/RNA-Extraktion umfassen: Zellaufschluss zur Freisetzung von Nukleinsäuren → Entfernung von Verunreinigungen (Proteine, Lipide, Polysaccharide usw.) → Reinigung von Nukleinsäuren. Die Rolle des Ultraschalls konzentriert sich hauptsächlich auf den ersten Schritt - effiziente Zellaufschließung und Nukleinsäurefreisetzung. Die spezifischen Anwendungsszenarien und Vorteile sind wie folgt:
1. Geeignete Probentypen
Ultraschall eignet sich für die Nukleinsäureextraktion einer Vielzahl von Proben, einschließlich:

Tierisches Gewebe (wie Leber, Muskel): muss zuerst in kleine Stücke geschnitten werden, Ultraschall kann Zellen schnell aufschließen und Nukleinsäuren freisetzen;
Bakterien/Pilze: Zellwände sind relativ hart, herkömmliche Methoden (wie Lysozymbehandlung) sind ineffizient, und Ultraschall kann Zellwände durch starken Kavitationseffekt zerstören;
Kulturzellen (adhärente oder suspendierte Zellen): direkte Suspension und dann Ultraschall, keine komplexen Vorbehandlungen erforderlich;
Pflanzengewebe: enthält Zellulose und Pektin, Ultraschall kann beim Aufbrechen von Zellwänden und der Freisetzung von Zellinhalten helfen.
2. Schlüsselparameter bei der Durchführung (beeinflussen die Nukleinsäurequalität)
Die Ultraschallbehandlung erfordert eine strenge Kontrolle der Parameter, um einen Nukleinsäureabbau oder eine übermäßige Fragmentierung (die nachfolgende Experimente wie PCR, Sequenzierung usw. beeinträchtigt) zu vermeiden:

Leistung: normalerweise 50-300 W (angepasst an den Probentyp, z. B. benötigen Bakterien eine höhere Leistung). Eine zu hohe Leistung führt dazu, dass die Nukleinsäure zu kurz geschnitten wird, und eine zu geringe Leistung führt zu einer unzureichenden Fragmentierung.
Arbeits-/Intervallzeit: Verwenden Sie eine "Puls"-Behandlung (z. B. 30 Sekunden arbeiten + 30 Sekunden Pause), um zu vermeiden, dass die kontinuierliche Ultraschallwärmeerzeugung zu einer Nukleinsäuredenaturierung führt (DNA/RNA wird bei hohen Temperaturen leicht abgebaut).
Gesamtbehandlungszeit: Hängt von der Probe ab (z. B. 1-3 Minuten für tierische Zellen und 3-5 Minuten für Bakterien). Eine übermäßige Behandlung verschlimmert die Nukleinsäurefragmentierung.
Temperaturkontrolle: Eisbad während des gesamten Prozesses (Proben werden auf Eis platziert), da der Ultraschallprozess Wärme erzeugt (Kavitationseffekt begleitet von lokaler hoher Temperatur), kann eine niedrige Temperatur die Nucleaseaktivität hemmen und die Nukleinsäurestabilität schützen.

3. Vorteile und Vorsichtsmaßnahmen
Vorteile
Hohe Effizienz: Schneller als herkömmliche Methoden (wie Mahlen, wiederholtes Einfrieren und Auftauen, enzymatische Hydrolyse) (normalerweise innerhalb weniger Minuten abgeschlossen) und gründlichere Aufschließung;
Universalität: Anwendbar auf eine Vielzahl von Probentypen (Tiere, Pflanzen, Mikroorganismen usw.);
Einfache Bedienung: Es werden keine komplexen Reagenzien benötigt, nur Ultraschallgeräte und grundlegende Zentrifugationsgeräte.
Vorsichtsmaßnahmen
Blasen vermeiden: Wenn sich eine große Anzahl von Blasen in der Probe befindet, wird die Effizienz des Kavitationseffekts verringert, und die Sonde kann überhitzen. Stellen Sie sicher, dass die Sonde vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist (der Flüssigkeitsstand beträgt etwa 1-2 cm);
Nuclease-Inhibition: Nach dem Aufschluss sollte rechtzeitig eine Lysepufferlösung (einschließlich EDTA, Detergens usw.) hinzugefügt werden, um intrazelluläre Nucleasen (wie RNase, die RNA leicht abbaut) zu hemmen;
Probenvolumen: Das Einzelverarbeitungsvolumen sollte nicht zu groß sein (normalerweise ≤5 ml), da sonst die Ultraschallenergieverteilung ungleichmäßig ist und der Aufschlusseffekt stark variiert.

Zusammenfassung
Ultraschall schließt Zellen effizient durch Kavitationseffekt und mechanische Vibration auf und bietet einen wichtigen "Freisetzungsschritt" für die DNA/RNA-Extraktion. Der Kern ist die Optimierung von Leistung, Zeit und Temperatur, um Zellen vollständig aufzuschließen und gleichzeitig die Integrität der Nukleinsäure zu maximieren. Diese Technologie wird häufig in der Vorverarbeitungsphase von molekularbiologischen Experimenten (wie Genklonierung, qPCR, Transkriptomanalyse usw.) eingesetzt und ist ein wichtiges Werkzeug für die Nukleinsäureextraktion.